Las bacterias expuestas a los medicamentos antivirales desarrollan un cruce de antibióticos

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 837 (2023) Citar este artículo

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Los medicamentos antivirales se utilizan en todo el mundo como tratamiento y profilaxis de infecciones virales agudas y de larga duración. Aunque también se ha demostrado que los antivirales tienen efectos no deseados sobre el crecimiento bacteriano, aún se desconocen las posibles contribuciones de los antivirales a la resistencia a los antimicrobianos. Aquí exploramos la capacidad de diferentes clases de medicamentos antivirales para inducir resistencia a los antimicrobianos. Nuestros resultados establecen la capacidad previamente no reconocida de los antivirales para alterar ampliamente los perfiles fenotípicos de resistencia a los antimicrobianos de las bacterias gramnegativas y grampositivas Escherichia coli y Bacillus cereus. Las bacterias expuestas a antivirales como zidovudina, dolutegravir y raltegravir desarrollaron resistencia cruzada a los antibióticos de uso común, como trimetoprima, tetraciclina, claritromicina, eritromicina y amoxicilina. La secuenciación del genoma completo de aislados de E. coli resistentes a los antivirales reveló numerosas mutaciones únicas de pares de bases únicas, así como inserciones y eliminaciones de pares de bases múltiples, en genes con funciones conocidas y sospechadas en la resistencia a los antimicrobianos, incluidos aquellos que codifican bombas de eflujo de múltiples fármacos y transporte de carbohidratos. y metabolismo celular. Los cambios fenotípicos observados junto con los resultados genotípicos indican que las bacterias expuestas a medicamentos antivirales con propiedades antibacterianas in vitro pueden desarrollar múltiples mutaciones de resistencia que confieren resistencia cruzada a los antibióticos. Nuestros hallazgos subrayan la contribución potencial del uso a gran escala de medicamentos antivirales al desarrollo y propagación de la resistencia a los antimicrobianos en los seres humanos y el medio ambiente.

Los medicamentos antivirales se utilizan en todo el mundo para tratar enfermedades virales que afectan a millones de vidas humanas. Los antivirales atenúan la infección viral al inhibir la capacidad de replicación de un virus, a menudo apuntando a las proteínas o enzimas utilizadas por un virus para infectar, multiplicar o liberar nuevas partículas virales de un huésped1. Actualmente (a partir de 2017) la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos ha aprobado noventa antivirales, incluidos antivirales de compuesto único y combinados para el virus de la influenza, la hepatitis B y C, el virus del herpes simple 1 y 2 y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). )2. Se estima que en todo el mundo hay 38 millones de personas infectadas por el VIH3. Trescientos veinticinco millones de personas viven con hepatitis B y/o C4, y más de 3.700 millones de casos de virus del herpes simple tipo 1 existen sólo en personas menores de 50 años5. Se estima que cada año se producen en todo el mundo entre tres y cinco millones de casos graves de infección por el virus de la gripe6. A medida que el número de casos de enfermedades virales aumenta cada año, se espera que también aumente el uso de medicamentos antivirales7. Algunas infecciones virales, como la influenza estacional, pueden tratarse únicamente con terapia antiviral a corto plazo; otros, como el VIH/SIDA, pueden requerir un tratamiento antiviral a largo plazo o de por vida. Además, la actual pandemia de SARS-CoV-2 se suma a la lista de enfermedades virales globales tratadas con medicamentos antivirales8.

Dado el amplio uso de medicamentos antivirales en todo el mundo, también se deben considerar las consecuencias imprevistas de los medicamentos antivirales. Los medicamentos antivirales están destinados a atacar específicamente la replicación viral; sin embargo, los antivirales pueden tener efectos no deseados, incluida la inhibición del crecimiento bacteriano9,10,11,12. La actividad antibacteriana de varios fármacos antivirales ha generado un mayor interés durante la última década en reutilizar los antivirales análogos de nucleósidos, en particular, para tratar infecciones bacterianas multirresistentes13,14,15. Sin embargo, la actividad antibacteriana de muchos fármacos antivirales también plantea la cuestión de si los antivirales pueden contribuir a la resistencia a los antimicrobianos, que abarca la presencia, el desarrollo, la diseminación y el tratamiento de infecciones resistentes a los antimicrobianos. A nivel mundial, la resistencia a los antimicrobianos es una de las diez principales amenazas para la salud humana16. Sólo en los Estados Unidos, hay más de 2,8 millones de infecciones resistentes a los antibióticos cada año y más de 35.000 muertes debido a la resistencia a los antibióticos17. La mayor parte del debate sobre el control de la resistencia a los antimicrobianos se centra en el uso sensato de los antibióticos recetados y la higiene18,19. Sin embargo, la comprensión del espectro completo de contribuyentes a la resistencia a los antimicrobianos sigue siendo incompleta. Los productos farmacéuticos no antibióticos, como los antivirales, también pueden contribuir al desarrollo de resistencia a los antimicrobianos a escala mundial, pero se necesita investigación para comprender plenamente cómo los medicamentos con propiedades antibacterianas pueden provocar mutaciones en las bacterias y provocar resistencia cruzada a los antibióticos.

Si bien se han demostrado las propiedades antibacterianas de muchos medicamentos antivirales, se desconoce en gran medida si las bacterias pueden volverse resistentes a estos antivirales y si las mutaciones de resistencia a los antivirales antibacterianos pueden conferir resistencia cruzada a otros agentes antibacterianos, incluidos los antibióticos. Se ha demostrado que los compuestos no farmacéuticos con efectos antimicrobianos, como algunos pesticidas y herbicidas, contribuyen a la resistencia a los antimicrobianos20,21,22. Se ha demostrado que otros fármacos no antibióticos, como los antidepresivos y los antiepilépticos, influyen en última instancia en la resistencia al aumentar las tasas de transferencia horizontal de genes, afectando objetivos iguales o similares a los de los antibióticos o provocando cambios en la expresión genética que afectan la resistencia a los antibióticos23,24. ,25. Por lo tanto, examinar los impactos fenotípicos y genotípicos de la exposición a medicamentos no antibióticos, como los antivirales, en las bacterias puede conducir a una mejor comprensión de la resistencia cruzada y los mecanismos que conducen a la resistencia. Más allá de las mutaciones genéticas comúnmente conocidas que causan resistencia a los antibióticos, nuevas mutaciones debidas a la exposición a fármacos no antibióticos pueden ser responsables de conferir resistencia cruzada a los antibióticos26. Al realizar la secuenciación del genoma completo, se pueden identificar nuevas mutaciones de resistencia para ayudar a explicar los fenotipos de resistencia27,28.

En este estudio, investigamos la eficacia antibacteriana de los antivirales y el potencial de resistencia cruzada a otros antivirales y antibióticos. Utilizando un enfoque basado en cultivos con las bacterias modelo E. coli y B. cereus, demostramos que los medicamentos antivirales tienen el potencial de contribuir a la resistencia a los antibióticos en bacterias gramnegativas y grampositivas. Si bien otros estudios han demostrado previamente las propiedades antibacterianas de algunos medicamentos antivirales, hasta donde sabemos, ningún otro trabajo ha informado aún en qué medida numerosos antivirales de diferentes clases pueden provocar resistencia cruzada a los antibióticos. Los resultados de este estudio sugieren que los medicamentos antivirales con propiedades antibacterianas pueden afectar el fenotipo de resistencia a los antimicrobianos de las bacterias; Una investigación adicional puede ayudar a dilucidar los mecanismos específicos por los cuales estos medicamentos y potencialmente otros pueden actuar sobre las bacterias y contribuir a la resistencia cruzada a los antibióticos.

Catorce medicamentos antivirales de cuatro clases antivirales diferentes (antiherpéticos, inhibidores nucleósidos de la transcriptasa inversa (NRTI), inhibidores de la integrasa (II), inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa inversa (NNRTI)) con una variedad de diferentes objetivos/modos de acción (Datos complementarios 1) fueron examinados para detectar actividad antibacteriana contra E. coli y B. cereus.

Demostrando resultados consistentes con trabajos anteriores10, ocho de los catorce antivirales probados inhibieron el crecimiento de E. coli, mientras que solo tres de los catorce mostraron actividad antibacteriana contra B. cereus (Fig. 1). Los antivirales abacavir, darunavir, nevirapina, tenofovir, favipiravir y emtricitabina no tuvieron un impacto significativo en el crecimiento de E. coli o B. cereus hasta 100 μg/mL durante 24 h (Figura 1 complementaria, Figura 2 complementaria) . Dolutegravir, efavirenz y raltegravir redujeron significativamente el crecimiento de E. coli y B. cereus, mientras que los análogos de nucleósidos aciclovir, didanosina, lamivudina, estavudina y zidovudina inhibieron significativamente E. coli pero no B. cereus (Fig. 1). Entre los antivirales que mostraron actividad antibacteriana, la inhibición del crecimiento se observó típicamente en concentraciones ≥ 50 μg/ml; sin embargo, la zidovudina inhibió significativamente el crecimiento de E. coli a 0,1 μg/ml (Fig. 1). La inhibición del crecimiento, vista por una reducción significativa en la densidad óptica (DO), se observó dentro de las 4 h de exposición para varios de los antivirales con actividad antibacteriana contra E. coli, y todos los antivirales con actividad antibacteriana inhibieron el crecimiento dentro de las 8 h (Fig. 1). En algunos casos, la importancia del efecto antimicrobiano se mantuvo en el tiempo, mientras que en otros cambió con el tiempo, ya sea aumentando o disminuyendo (Fig. 1). Fuimos conservadores con lo que consideramos una inhibición significativa del crecimiento, y requerimos una reducción tanto significativa (p <0,005) como sustancial (>10%) en el crecimiento de las bacterias tratadas con antivirales en comparación con los controles no tratados (Datos complementarios 3, Figura complementaria .2). Las diferencias se determinaron significativas si el valor p de la prueba t alcanzaba el umbral (p <0,005). Todas las diferencias significativas se diferenciaron aún más según su grado de significancia (de mayor a menos significativa: p <0,00005, p <0,0005, p <0,005) con fines comparativos. Los resultados que no fueron significativos se interpretaron como una diferencia no significativa en el crecimiento entre la condición tratada con el medicamento y la condición no tratada.

a Efectos antibacterianos de los antivirales después de 4 a 24 h de exposición a diferentes concentraciones antivirales que oscilan entre 0,1 y 100 μg/ml. Los análogos de nucleósidos aciclovir, didanosina, lamivudina, estavudina y zidovudina afectan únicamente el crecimiento de E. coli. Tanto E. coli como B. cereus son inhibidos significativamente (con al menos un 10% de reducción en el crecimiento en comparación con el control) por el inhibidor no nucleósido de la transcriptasa inversa efavirenz y los inhibidores de la integrasa dolutegravir y raltegravir en concentraciones de 10 a 100 μg/ml a partir de 4 h de tiempo de exposición para E. coli y 8 h para B. cereus. b Ejemplo de curvas de crecimiento para E. coli tratada con 0,1 a 100 μg/ml de aciclovir durante 24 h. La diferencia más significativa en el crecimiento, como se observa en la curva de crecimiento y en el mapa de calor (a), es solo de 8 a 24 h con 100 μg/ml de aciclovir. c Ejemplo de curvas de crecimiento para E. coli tratada con 0,1 a 100 μg/ml de zidovudina durante 24 h. Se observan diferencias significativas entre E. coli no tratada y tratada con zidovudina en todas las concentraciones analizadas y en todos los puntos temporales de 4 a 24 h.

Después de demostrar que ocho de los antivirales probados tuvieron efectos antibacterianos significativos sobre el crecimiento de E. coli y tres impactaron el crecimiento de B. cereus, exploramos el potencial de las bacterias para volverse resistentes a los efectos antibacterianos de estos antivirales tras la exposición repetida a los fármaco investigado. Las cepas resistentes a los antivirales que se aislaron incluyeron E. coli resistente a zidovudina, resistente a lamivudina, resistente a estavudina y resistente a didanosina. Se aislaron cepas resistentes a dolutegravir y raltegravir tanto para E. coli como para B. cereus. Las cepas resistentes lograron un crecimiento máximo y una cinética de crecimiento similares en comparación con el tipo salvaje, con la excepción de la cepa resistente a zidovudina de E. coli que logró un crecimiento máximo un 32 % menor en comparación con el tipo salvaje (Datos complementarios 4; Figura complementaria 3). Durante el período de incubación de 4 a 12 h, mientras las bacterias estaban en la fase logarítmica y la DO aumentaba rápidamente, B. cereus de tipo salvaje mostró un aumento promedio en la DO de 0,162 (absorbancia, 600 nm) por hora, y las cepas resistentes a los antivirales mostró un aumento de 0,154 por hora. E. coli de tipo salvaje mostró un aumento de OD de 0,162 por hora, y las cepas resistentes a los antivirales (excluyendo E. coli resistente a zidovudina) mostraron un aumento promedio de OD de 0,199 por hora (Datos complementarios 4). Se observó resistencia a los antivirales en concentraciones subinhibitorias, típicamente <100 μg/ml (Datos complementarios 5; Figura complementaria 4). No se observó resistencia en los tratamientos con efavirenz tanto para E. coli como para B. cereus; Se observó resistencia en los tratamientos con aciclovir de E. coli, pero no se aisló una cepa resistente (Datos complementarios 5).

La resistencia a un fármaco antiviral confirió resistencia cruzada a otros fármacos antivirales para las seis cepas resistentes de E. coli y ambas de B. cereus desarrolladas (Fig. 2, Datos complementarios 6). Aunque cada cepa mostró un patrón único de resistencia cruzada a otros antivirales, los perfiles de resistencia cruzada se agruparon en algunos casos según la clase de antiviral de la que se aisló cada cepa (Figura complementaria 5). Por ejemplo, los mutantes de E. coli aislados de los tratamientos con NRTI lamivudina y estavudina tuvieron resistencia cruzada a los NRTI lamivudina, estavudina y didanosina, pero fueron susceptibles a zidovudina (NRTI), dolutegravir (II) y efavirenz (NNRTI). Estas cepas se agruparon y también fueron similares a la cepa NRTI resistente a didanosina (cuyo perfil estaba más estrechamente relacionado con E. coli de tipo salvaje que con las cepas resistentes a lamivudina y estavudina). Asimismo, las cepas resistentes a los inhibidores de la integrasa dolutegravir y raltegravir mostraron perfiles de resistencia cruzada similares y se agruparon. Estas cepas se caracterizaron por una resistencia cruzada más amplia que las cepas resistentes a NRTI y fueron resistentes a todos los antivirales probados excepto a la zidovudina. A pesar de ser un NRTI como lamivudina, estavudina y didanosina, la cepa de E. coli resistente a zidovudina exhibió un perfil de resistencia cruzada excepcionalmente amplio que era más similar a los perfiles de resistencia de las cepas resistentes a los inhibidores de la integrasa, pero que se destacaba de manera única. E. coli resistente a zidovudina fue la única cepa resistente a análogos de nucleósidos que mostró resistencia cruzada a NNRTI efavirenz en comparación con el tipo salvaje (crecimiento del 40 % en comparación con el 18 % de crecimiento para E. coli de tipo salvaje), así como con la propia zidovudina.

a En comparación con la E. coli de tipo salvaje, las cepas resistentes a los antivirales muestran resistencia cruzada a múltiples antivirales, y se observan perfiles de resistencia únicos para todas las cepas mutantes de E. coli resistentes a los INTI (resistentes a didanosina, Didanosina-R; resistentes a lamivudina). , Lamivudina-R; resistente a estavudina, Stavudina-R; resistente a zidovudina, Zidovudina-R) e inhibidores de la integrasa (resistente a dolutegravir, Dolutegravir-R; resistente a raltegravir, Raltegravir-R). b Las cepas de B. cereus dolutegravir-R y Raltegravir-R son resistentes a efavirenz y dolutegravir en comparación con las cepas de B. cereus de tipo salvaje.

Las cepas aisladas de E. coli y B. cereus resistentes a los inhibidores de la integrasa dolutegravir y raltegravir demostraron similitudes en su resistencia cruzada a efavirenz, dolutegravir y raltegravir (Fig. 2a, b). B. cereus resistente a raltegravir fue resistente a efavirenz en comparación con B. cereus de tipo salvaje (crecimiento del 93 % frente al 9 % de crecimiento). Curiosamente, la cepa mutante de B. cereus resistente a raltegravir mostró una mayor resistencia a dolutegravir en comparación con la "cepa resistente a dolutegravir" que se desarrolló en presencia de dolutegravir y se aisló para pruebas de resistencia cruzada (Fig. 2b). En general, se demostró que las cepas resistentes a los antivirales tenían fenotipos de resistencia estables, como se demostró en 15 pases. Por ejemplo, B. cereus resistente a dolutegravir mantuvo la resistencia a raltegravir, dolutegravir y efavirenz durante todo el pase en ausencia de dolutegravir; E. coli resistente a zidovudina mantuvo la resistencia a zidovudina durante 15 pases en ausencia de zidovudina (Datos complementarios 7).

Exploramos más a fondo el alcance de la resistencia adquirida en E. coli y B. cereus desafiando las cepas aisladas resistentes a los antivirales con diez antibióticos de amplio espectro comúnmente recetados (Datos complementarios 8). Las concentraciones finales de antibióticos utilizadas para desafiar a E. coli y B. cereus de tipo salvaje y mutante se seleccionaron después de desafiar primero cada cepa individual y luego elegir una concentración que capturara el rango de respuesta al fármaco (es decir, cambios en el crecimiento) en todo el tipo salvaje. y cepas mutantes resistentes a antivirales para análisis comparativos. De manera similar a sus resistencias cruzadas con otros antivirales, las cepas de E. coli y B. cereus resistentes a los antivirales mostraron patrones únicos de resistencia/susceptibilidad a los antibióticos (Fig. 3, Fig. 4, ver Datos complementarios 9 para determinaciones de importancia). Algunas cepas mutantes demostraron una fuerte resistencia a los antibióticos y algunas cepas eran más susceptibles a los antibióticos en comparación con el control de tipo salvaje. Los mutantes de E. coli y B. cereus resistentes al mismo antiviral mostraron diferentes resistencias cruzadas a los antibióticos. Por ejemplo, E. coli resistente a dolutegravir mostró cierta resistencia a la tetraciclina y la oxitetraciclina (Fig. 3), mientras que B. cereus resistente a dolutegravir fue más susceptible a la tetraciclina y la oxitetraciclina en comparación con el tipo salvaje (Fig. 4).

Sin embargo, algunos mutantes de E. coli resistentes a los antivirales son más susceptibles a algunos antibióticos en comparación con la E. coli de tipo salvaje, incluida una mayor susceptibilidad de la E. coli resistente a la didanosina (Didanosina-R) a la amoxicilina y la gentamicina. Los asteriscos (*) indican una diferencia significativa en comparación con el tipo salvaje (p < 0,05 y al menos un 10% de diferencia sustancial en el crecimiento entre el tipo salvaje tratado y la cepa resistente); las barras representan valores máximo, mínimo y medio para n = 3 mediciones de absorbancia.

Sin embargo, los mutantes resistentes a los antivirales de B. cereus resistentes a raltegravir (Raltegravir-R) y resistentes a dolutegravir (Dolutegravir-R) a menudo eran igual o más susceptibles a los antibióticos en comparación con B. cereus de tipo salvaje, como lo ilustra su respuesta a la oxitetraciclina o espectinomicina. Los asteriscos (*) indican una diferencia significativa en comparación con el tipo salvaje (p < 0,05 y al menos un 10% de diferencia sustancial en el crecimiento entre el tipo salvaje tratado y la cepa resistente); las barras representan valores máximo, mínimo y medio para n = 3 mediciones de absorbancia.

La mayoría de las cepas mutantes de E. coli resistentes a los antivirales mostraron varias resistencias cruzadas a los antibióticos fuertes. E. coli resistente a raltegravir, dolutegravir y zidovudina mostró resistencia a claritromicina y eritromicina (antibióticos macrólidos) (Fig. 3). E. coli resistente a zidovudina y lamivudina fueron resistentes a trimetoprima. Las cepas de E. coli resistentes a dolutegravir y zidovudina mostraron resistencia cruzada a la tetraciclina. En comparación con la E. coli de tipo salvaje, la E. coli resistente a dolutegravir también mostró una menor susceptibilidad a la amoxicilina, la espectinomicina y el sulfametoxazol (24 frente a 90 %, 54 frente a 77 %, 56 frente a 70 %, crecimiento de tipo salvaje frente a resistente a dolutegravir, respectivamente) además de los antibióticos macrólidos y tetraciclinas (Fig. 3, Datos complementarios 10). Algunas cepas de E. coli resistentes a los antivirales eran más susceptibles a los antibióticos en comparación con la E. coli de tipo salvaje. Se observó una mayor susceptibilidad de E. coli resistente a lamivudina y didanosina a la amoxicilina y de E. coli resistente a raltegravir a la oxitetraciclina. Cuando se trataron con gentamicina (aminoglucósido), tanto E. coli resistente a raltegravir como resistente a zidovudina fueron más resistentes en comparación con E. coli de tipo salvaje (46 % frente a 32 % de crecimiento para las resistentes a raltegravir, y 92 % frente a 32 % para las resistentes a zidovudina). E. coli resistente).

Las cepas de B. cereus resistentes a raltegravir y dolutegravir fueron más susceptibles o comparablemente susceptibles a siete de cada diez antibióticos probados en comparación con el B. cereus de tipo salvaje. Tanto B. cereus resistente a dolutegravir como resistente a raltegravir fueron igualmente susceptibles a la amoxicilina y al sulfametoxazol en comparación con el tipo salvaje (Fig. 4). Las cepas fueron más susceptibles a espectinomicina, tetraciclina, trimetoprima, oxitetraciclina y cloranfenicol en comparación con B. cereus de tipo salvaje (Fig. 4). Sin embargo, para los antibióticos gentamicina, eritromicina y claritromicina, las cepas resistentes a los antivirales mostraron una mayor resistencia en comparación con el tipo salvaje B. cereus: sólo B. cereus resistente a dolutegravir fue resistente a la gentamicina; De manera similar a E. coli resistente a dolutegravir y resistente a raltegravir, B. cereus resistente a dolutegravir y resistente a raltegravir fueron resistentes a claritromicina y eritromicina. Cuando se trató con 1 μg/ml de eritromicina, B. cereus de tipo salvaje mostró en promedio solo un crecimiento del 7 % en relación con el tipo salvaje no tratado, mientras que B. cereus resistente a dolutegravir exhibió un crecimiento de 90 % en relación con el resistente a dolutegravir no tratado. B. cereus resistente a raltegravir mostró un crecimiento del 76 % en relación con los resistentes a raltegravir no tratados en presencia de eritromicina. Cuando se expuso a 0,1 μg/ml de claritromicina, B. cereus de tipo salvaje mostró un crecimiento del 9%, mientras que las cepas resistentes a dolutegravir y resistentes a raltegravir exhibieron un crecimiento del 103% y del 75%, respectivamente.

Tras nuestros resultados que demuestran que E. coli resistente a los antivirales puede exhibir una amplia resistencia cruzada a los antibióticos, quisimos contextualizar la relevancia clínica de la supervivencia y el crecimiento de E. coli resistente a los antivirales. Para validar los fenotipos de resistencia cruzada a los antibióticos de las cepas resistentes a los antivirales y el método in vitro de evaluación de la resistencia, desafiamos una cepa de E. coli resistente a múltiples fármacos bien caracterizada (ATCC BAA-2471, muestra respiratoria clínica) con el mismo antibióticos y concentraciones utilizadas para desafiar las cepas de E. coli resistentes a los antivirales. E. coli BAA-2471 exhibe resistencia a muchas clases de antibióticos, incluidas penicilinas, cefalosporinas, carbapenémicos, quinolonas, aminoglucósidos y otros29. Por lo tanto, la cepa es resistente a los antibióticos que probamos, incluidos amoxicilina, gentamicina, tetraciclina, trimetoprima y sulfametoxazol. Confirmamos la resistencia de BAA-2471 a estos antibióticos utilizando nuestros métodos y también comparamos la resistencia o susceptibilidad de la cepa a los medicamentos antivirales (Fig. 5, Datos complementarios 11). E. coli resistente a zidovudina (la cepa de E. coli resistente a los antivirales con el perfil de resistencia más amplio) y BAA-2471 no tratado exhibieron una cinética de crecimiento comparable. De hecho, se observó resistencia a todos los antibióticos a los que BAA-2471 era supuestamente resistente, y el crecimiento de BAA-2471 y E. coli resistente a zidovudina en presencia de tratamiento con antibióticos fue comparable (Fig. 5, Datos complementarios 15). Si bien tanto BAA-2471 como E. coli resistente a zidovudina demostraron crecimiento en presencia de 3 μg/ml de gentamicina, encontramos que el crecimiento de BAA-2471 se inhibió a las 16 h de incubación con 5 μg/ml de gentamicina en nuestros ensayos, mientras que las E. coli resistentes a zidovudina demostraron crecimiento en presencia de 3 μg/ml de gentamicina. E. coli no fue susceptible (Fig. 3, Datos complementarios 11). En presencia de 50 μg/ml de zidovudina, después de 16 h de incubación, E. coli resistente a zidovudina exhibió un crecimiento del 120 % en comparación con el control no tratado, mientras que BAA-2471 exhibió solo un crecimiento del 48 % (Fig. 5, Datos complementarios 15). Estos resultados validaron nuestro enfoque para evaluar los perfiles fenotípicos de resistencia de cepas resistentes y permitieron un análisis comparativo del crecimiento bacteriano en presencia y ausencia de medicamentos antivirales y antibióticos utilizando un aislado clínico resistente bien caracterizado.

Como se esperaba, el aislado clínico de E. coli resistente a múltiples fármacos BAA-2471 es resistente a la amoxicilina y la tetraciclina en las concentraciones analizadas, mientras que la E. coli de tipo salvaje fue susceptible a estas concentraciones (la respuesta de tipo salvaje se muestra en la Fig. 3). Las curvas de crecimiento de E. coli resistente a zidovudina (AZT-R) demuestran la misma resistencia que BAA-2471 a los antibióticos y al antiviral dolutegravir. Sin embargo, BAA-2471 es susceptible a la zidovudina. Para cada momento, n = 3 réplicas técnicas; La absorbancia media se traza para cada punto de tiempo, y la ausencia de barras de error observables en cualquier punto de datos es indicativa de una estrecha alineación de mediciones por triplicado.

Además, los resultados sugieren que E. coli resistente a zidovudina exhibe mutaciones de resistencia que son únicas en comparación con el aislado clínico BAA-2471, pero que otorgan una aptitud comparable en ausencia del fármaco y una supervivencia comparable en presencia de concentraciones de antibióticos que son inhibidoras del tipo salvaje. .

Después de observar que los aislados de E. coli y B. cereus resistentes a los antivirales tienen cambios fenotípicos únicos en la resistencia a los antibióticos en comparación con el tipo salvaje, realizamos la secuenciación del genoma completo de cepas de E. coli resistentes a los antivirales con el objetivo de identificar cambios genéticos que puedan Explicar la resistencia a los medicamentos antivirales o a los antibióticos. No se pudo realizar una genómica comparativa de aislados de B. cereus debido a la contaminación durante la preparación de la biblioteca de cepas de referencia y al pequeño número de cepas mutantes. En general, hubo tan solo dos y hasta 23 cambios genéticos únicos en los genomas mutantes de E. coli resistentes a los antivirales en comparación con la cepa de referencia que no pudieron atribuirse ni a un cambio en la referencia durante la secuenciación (diferencias encontradas en todos los genomas mutantes) o a un error de secuenciación (p. ej., inserción de A dentro de la secuencia del homopolímero A) (Datos complementarios 13). Mutaciones observadas en tres de las cepas mutantes (E. coli resistente a raltegravir, [CP117043]; E. coli resistente a dolutegravir, [CP117044]; E. coli resistente a didanosina, [CP115968]; Fig. 6, Fig. 7) tenía cambios genéticos en genes con funciones establecidas en la resistencia a los antibióticos. Los aislados de E. coli resistentes a raltegravir y dolutegravir (ambas cepas resistentes a inhibidores de la integrasa) tienen el mismo cambio de base (A→G), lo que conduce a un cambio de aminoácido no sinónimo (Y→C) en el regulador transcripcional global activado por AMPc. crp (Fig. 7), asociado con la resistencia a los macrólidos, lo que potencialmente explica parte del fenotipo de resistencia adquirida a los antibióticos de estos dos antivirales de la misma clase de antivirales. En el aislado de E. coli resistente a dolutegravir se observó una mutación en la bomba de eflujo de múltiples fármacos, la permeasa acrB del transportador de resistencia-nodulación-división (RND) de eflujo. En este caso, la mutación observada provocó un aumento del 1,8% en la longitud de la proteína (Fig. 7) y puede explicar la resistencia observada a la tetraciclina30,31,32,33. En E. coli resistente a didanosina, se observó una deleción en la permeasa transportadora ABC yhdY (deleción de un solo par de bases en el codón 232), lo que sugiere una función potencialmente alterada de esta familia de proteínas involucrada en el transporte de una variedad de sustituyentes que incluyen no solo carbohidratos, proteínas y lípidos, pero también fármacos34 (Fig. 6). El codón de parada temprano introducido por la eliminación de un solo par de bases condujo a una reducción del 35,2% en la longitud de la proteína. Además, dos mutantes expuestos a análogos de nucleósidos (E, coli resistente a lamivudina, [CP115179], análogo de citidina; E, coli resistente a zidovudina, [CP117469], análogo de timidina) tuvieron diferentes cambios genéticos dentro del gen de la timidina quinasa (tdk), lo que sugiere un papel en la resistencia a los fármacos antivirales análogos de nucleósidos (Datos complementarios 13).

El resaltado en azul indica un papel conocido en la resistencia a los antimicrobianos; El resaltado verde indica un papel sugerido recientemente en la resistencia. +Número de acceso que aparece debajo de cada genoma. *La columna “Mutación” enumera primero entre paréntesis el número de codón en el gen de referencia de tipo salvaje que está mutado en comparación con la cepa resistente a los antivirales, seguido de la mutación descrita como la abreviatura de una sola letra del aminoácido y la secuencia del tipo salvaje y el único. Abreviatura de letra de aminoácido y secuencia alterada en el gen mutante resistente a antivirales.

El resaltado en azul indica un papel conocido en la resistencia a los antimicrobianos; El resaltado verde indica un papel sugerido recientemente en la resistencia. +Número de acceso que aparece debajo de cada genoma. *La columna “Mutación” enumera primero entre paréntesis el número de codón en el gen de referencia de tipo salvaje que está mutado en comparación con la cepa resistente a los antivirales, seguido de la mutación descrita como la abreviatura de una sola letra del aminoácido y la secuencia del tipo salvaje y el único. Abreviatura de letra de aminoácido y secuencia alterada en el gen mutante resistente a antivirales. #La proteína aumentó su longitud en un 1,8% debido a la mutación observada.

Otras mutaciones que causan cambios sustanciales en las secuencias de proteínas observadas en E. coli resistente a los antivirales se localizaron en genes implicados en la resistencia a los antibióticos en estudios recientes. Por ejemplo, se observaron mutaciones en la región codificante de la subunidad transportadora IIB (agaV) específica de N-acetilgalactosamina del sistema fosfotransferasa (PTS) en E. coli resistente a dolutegravir. Este sistema participa en el transporte de carbohidratos, aunque las mutaciones en PTS también se han asociado con una tolerancia total a los antimicrobianos26 (Fig. 7). La mutación en agaV provocó una reducción del 47,6% en la longitud de la proteína. Además, en E. coli resistente a dolutegravir, se observó una inserción de cinco pares de bases en el dominio sensorial de la proteína de la familia de las quinasas sensoras de dos componentes, que consta de una histidina quinasa y un regulador de respuesta afín. Varias mutaciones en esta familia de proteínas se han relacionado con la resistencia a los antimicrobianos35. E. coli resistente a lamivudina exhibió una eliminación de un solo par de bases en la región que codifica hexosa-6-fosfato: antiportador de fosfato (uhpT), lo que llevó a un truncamiento del 73,1% de la proteína (Fig. 6). Este antiportador participa en el intercambio de hexosa-6-fosfato (que podría incluir los azúcares de seis carbonos glucosa-6-fosfato, fructosa-6-fosfato y manosa-6-fosfato) y fosfato a través de la membrana celular, y tiene también ha sido implicado en la resistencia a los antibióticos36. Se observó una eliminación de un solo par de bases en tRNA1Val (adenina37-N6) -metiltransferasa en E. coli resistente a estavudina, lo que provocó el truncamiento del 52% de la proteína (Fig. 6). Esta metiltransferasa particular metila la adenina en la posición 37 del ARNt1 (Val). E. coli resistente a didanosina también exhibió cuatro deleciones de un solo par de bases en el codón 50 de la proteína de unión a galactofuranosa (ytfQ), un transportador ABC involucrado en el transporte de galactofuranosa típicamente en condiciones de eliminación de carbono, pero recientemente como un gen predictivo de resistencia a los antimicrobianos37 (Fig. 6). ). El simportador de sodio/glutamato poseía una inserción de un solo par de bases que provocaba el truncamiento del diez por ciento de la proteína en E. coli resistente a dolutegravir. Aunque se necesita más trabajo para determinar cuáles de los cambios genéticos observados en los genomas mutantes son importantes para los fenotipos antivirales o antimicrobianos adquiridos, hemos presentado varios candidatos probables con un papel conocido en la resistencia a los antibióticos y que han conducido a los mayores cambios en secuencias de proteínas.

Para investigar si las mutaciones potencialmente implicadas en la resistencia a los antivirales y la resistencia cruzada a los antibióticos podrían observarse en un modelo caracterizado de E. coli resistente a múltiples fármacos, examinamos la secuencia completa del genoma disponible públicamente para BAA-2471. Al comparar E. coli BAA-2471 resistente a múltiples fármacos con cepas de E. coli resistentes a los antivirales, ninguna de las mutaciones observadas en las cepas de E. coli resistentes a los antivirales que conducen al truncamiento de proteínas se observó en BAA-2471 (Datos complementarios 14). Por ejemplo, las mutaciones en timidina quinasa y aspartato quinasa/homoserina deshidrogenasa bifuncional que caracterizaron a E. coli resistente a zidovudina no se observaron en BAA-2471. Todos los genes que contenían inserciones o eliminaciones en mutantes de E. coli resistentes a los antivirales estaban intactos para BAA-2471 y eran comparables a los de E. coli de tipo salvaje.

A pesar de las crecientes preocupaciones de salud pública con respecto al desarrollo y la propagación de la resistencia a los antimicrobianos, los agentes que contribuyen al desarrollo de resistencia más allá de los antibióticos siguen sin comprenderse completamente21,38,39,40,41,42. Los esfuerzos para controlar la resistencia a los antibióticos se centran principalmente en la administración de antibióticos para la prescripción de antibióticos43, pero sin prestar atención a otros fármacos con propiedades antimicrobianas. Los antivirales tienen un uso generalizado a nivel mundial, efectos antibacterianos conocidos e incluso se han considerado como tratamiento para infecciones bacterianas resistentes a los medicamentos13,15. Hasta la fecha, ningún estudio del que tengamos conocimiento haya explorado el potencial de los medicamentos antivirales para contribuir a la resistencia a los antimicrobianos. En este trabajo, examinamos la actividad antibacteriana de catorce fármacos antivirales de diferentes clases antivirales para determinar su potencial para contribuir a la resistencia antiviral y la resistencia cruzada a los antibióticos. Nuestros hallazgos indican que, además de los antibióticos, los medicamentos antivirales que exhiben propiedades antibacterianas también pueden contribuir a la carga de resistencia a los antibióticos.

Se eligieron E. coli gramnegativas y B. cereus grampositivas como organismos modelo bien caracterizados para investigaciones con relevancia ambiental y clínica44,45,46. Los antivirales se probaron en concentraciones que oscilaron entre 0,1 y 100 μg/ml durante 0 a 24 h (Fig. 1). El rango de concentración probado cubre concentraciones inhibidoras y subinhibitorias demostradas en pruebas in vitro anteriores con bacterias10,11,12. Incluimos concentraciones probadas en la literatura existente para garantizar resultados reproducibles y validar nuestros métodos. El rango de concentración analizado también incluye concentraciones terapéuticas o circulantes de medicamentos antivirales, como la concentración plasmática de zidovudina (0,016–1,7 mg/L)47 y la ventana terapéutica de efavirenz (1–4 mg/L)48, así como concentraciones de antivirales detectados en el medio acuático que pueden alcanzar concentraciones en el rango de μg/L49. Sin embargo, en un intento por establecer valores inhibidores para diversos períodos de incubación y concentraciones de exposición, los rangos de concentración probados generalmente excedieron los niveles detectados ambientalmente o una concentración plasmática típica en el cuerpo humano50.

Aislamos con éxito mutantes de E. coli y B. cereus resistentes a los antivirales después de exponer repetidamente las bacterias a medicamentos antivirales con propiedades antibacterianas demostradas. Cuando las cepas resistentes a los antivirales se enfrentaron a antibióticos y otros fármacos antivirales, cada cepa resistente mostró un perfil fenotípico único de resistencia a los fármacos antivirales y antibióticos. Los perfiles de resistencia y resistencia cruzada de las cepas resistentes a los antivirales parecieron agruparse por clase de fármaco antiviral, pero ninguna mostró una resistencia fenotípica idéntica. Los resultados sugieren que, a pesar de la similitud estructural basada en la clase de fármaco en algunos casos, los fármacos antivirales pueden actuar a través de vías diferentes y posiblemente múltiples para ejercer sus propiedades antibacterianas. Por lo tanto, los mutantes resistentes pueden poseer un conjunto único de mutaciones que confieren resistencia a los fármacos antivirales y a los antibióticos.

En algunos casos, las mutaciones de resistencia a los antivirales conferían una mayor susceptibilidad a algunos antibióticos cuando se desafiaba a las cepas resistentes a realizar pruebas de resistencia cruzada. Sin embargo, la mayor sensibilidad a clases particulares de antibióticos en las cepas de B. cereus resistentes a dolutegravir y raltegravir, por ejemplo, puede no ser sorprendente si se considera junto con los resultados de otros estudios que han observado una mayor susceptibilidad de ciertas cepas de B. cereus resistentes a los medicamentos. bacterias a otras clases de antibióticos28,51. Los costos de aptitud física y otros cambios en la susceptibilidad debido a mutaciones de resistencia también se han descrito en otros lugares39,52,53. El crecimiento máximo reducido de E. coli resistente a zidovudina en comparación con el tipo salvaje (Datos complementarios 4) y el crecimiento comparable con BAA-2471 resistente a múltiples fármacos (Fig. 5) puede sugerir cómo las mutaciones observadas en esta cepa resistente tienen un costo metabólico. al microorganismo. Sin embargo, la estabilidad de las mutaciones durante el paso, incluso en ausencia del fármaco, sugiere que es favorable mantener la mutación o que es difícil revertirla54 (Datos complementarios 7). Una investigación adicional puede ayudar a esclarecer dónde y cómo los medicamentos antivirales ejercen su influencia antimicrobiana en la replicación o el metabolismo celular y cómo las condiciones de crecimiento también impactan los efectos de los antimicrobianos en las bacterias55. El nivel de importancia del efecto antimicrobiano puede ayudar a indicar que algunos fármacos actúan tempranamente en la destrucción celular, mientras que otros sólo surten efecto después de una incubación más prolongada.

Los resultados de la secuenciación del genoma completo proporcionaron evidencia adicional de que cada cepa de E. coli resistente a los antivirales poseía mutaciones únicas que confieren resistencia cruzada a diferentes clases de medicamentos antivirales o antibióticos. Las mutaciones consistieron principalmente en inserciones y eliminaciones de un solo par de bases. Si bien los resultados obtenidos de la secuenciación del genoma completo no pueden explicar directamente los perfiles de resistencia fenotípica sin una investigación biológica más profunda, los resultados sugieren vías y objetivos que pueden estar involucrados en la resistencia causada por la exposición a medicamentos antivirales. Dos de los seis aislados de E. coli con una mutación en el mismo gen (gen de la timidina quinasa tdk) sugieren que el metabolismo alterado de los nucleósidos podría ser un mecanismo importante para proteger contra los efectos antimicrobianos de los análogos de los nucleósidos. La timidina quinasa fosforila la timidina y la desoxiuridina, las cuales participan en numerosas vías metabólicas en E. coli56,57.

Dos de los seis aislados de E. coli también tuvieron el mismo cambio genético en un regulador transcripcional global, lo que también sugiere que la regulación genética puede desempeñar un papel importante. También es de destacar la mutación observada en tRNA1Val (adenina37-N6) -metiltransferasa en E. coli resistente a estavudina. Estudios recientes han señalado el papel de los genes de modificación del ARNt en la resistencia a numerosas clases de antibióticos58,59. Finalmente, se identificaron mutaciones en varios transportadores, incluido el transportador ABC permeasa yhdY, el transportador PTS específico de N-acetilgalactosamina agaV, el antiportador de hexosa-6-fosfato:fosfato uhpT y la proteína de unión a galactofuranosa del transportador ABC ytfQ, lo que se suma a la importante Papel de los procesos de membrana en los mecanismos de resistencia a los antibióticos.

Aunque varias de las mutaciones genéticas observadas en aislados resistentes a los antivirales ocurrieron en proteínas o vías con roles conocidos o sospechados en la resistencia a los antimicrobianos, la mayoría de los cambios genéticos ocurrieron en genes que no se sabe que estén involucrados en la resistencia a los antibióticos. Curiosamente, se sabe que muchos de los genes en los que ocurrieron las mutaciones están involucrados en aspectos del metabolismo y el transporte de nutrientes, como la proteína de unión a galactofuranosa, el transportador de sodio/glutamato y la aspartato quinasa bifuncional/homoserina deshidrogenasa I. Consistente con la literatura existente que sugieren que una serie de vías metabólicas pueden estar implicadas en la resistencia a los antimicrobianos o pueden proporcionar objetivos para nuevas terapias para infecciones bacterianas multirresistentes26,35,60,61,62, estas mutaciones aún pueden apuntar a genes clave involucrados en la resistencia a los medicamentos antivirales y enfermedades asociadas. resistencia cruzada a los antibióticos. Muchos genes más allá de los tradicionalmente considerados responsables de la resistencia a los antibióticos se han destacado como relevantes para los aislados clínicos con resistencia a los antibióticos, como las mutaciones en la N-acetilglicosima desacetilasa63, la glicerol quinasa27, la glicostransferasa64, la serina-treonina quinasa65 y la histidina quinasa66. Dado el interés en identificar mutaciones que podrían ser causantes del fenotipo de resistencia, las mutaciones en genes como los identificados en este estudio pueden indicar cómo los fármacos no antibióticos aún pueden tener efectos antimicrobianos y de dónde puede surgir una amplia resistencia a los antimicrobianos. Además, los genes identificados en este estudio pueden señalar vías que pueden estar implicadas en la resistencia y, por tanto, servir como objetivos para nuevas terapias más allá de los antibióticos tradicionales. Las mutaciones identificadas en genomas resistentes a los antivirales pueden ayudar a explicar los fenotipos de resistencia cruzada a los antibióticos debido a la exposición a los antivirales. Las mutaciones identificadas también pueden proporcionar más apoyo a que las mutaciones en genes más allá de los genes de resistencia tradicionales puedan estar implicadas en una variedad de resistencia a los antimicrobianos.

E. coli resistente a los antivirales exhibió resistencia fenotípica en muchas clases de antimicrobianos estructuralmente distintos, sin embargo, los resultados de la secuenciación del genoma completo de E. coli resistente a los antivirales revelaron relativamente pocas mutaciones de pares de bases en comparación con E. coli de tipo salvaje. Por lo tanto, estas pocas mutaciones seleccionadas pueden tener implicaciones de amplio alcance para una resistencia cruzada amplia. La mayoría de las cepas resistentes a los antivirales exhibieron menos de diez cambios genéticos únicos en comparación con el tipo salvaje. Por ejemplo, E. coli resistente a zidovudina exhibió con diferencia el perfil fenotípico de resistencia más amplio a todos los fármacos antivirales y antibióticos probados, pero exhibió sólo dos mutaciones genómicas únicas en las regiones codificantes: en el gen de la timidina quinasa y en la aspartato quinasa bifuncional/homoserina deshidrogenasa I. Otros estudios han asociado un fenotipo resistente a zidovudina con mutaciones en la timidina quinasa9,67,68. Sin embargo, Doléans-Jordheim et al. evaluaron sólo mutantes espontáneos resistentes a zidovudina, en lugar de mutantes aislados después de una exposición repetida a zidovudina, y el análisis genético se limitó únicamente al gen de la timidina quinasa, en lugar de a todo el genoma. Doléans-Jordheim et al. no informaron evidencia de resistencia cruzada a antibióticos en mutantes espontáneos resistentes a zidovudina, pero se observó la estabilidad de la resistencia a zidovudina, como ocurrió en nuestro estudio. Es posible que una mutación genética más allá de la timidina quinasa sola sea responsable de la amplia resistencia cruzada observada en nuestra E. coli resistente a la zidovudina y que la exposición repetida al fármaco también sea necesaria para inducir mutaciones de resistencia que confieren resistencia cruzada a otros antimicrobianos. Hasta donde sabemos, ningún estudio ha investigado cómo las mutaciones en la aspartato quinasa bifuncional/homoserina deshidrogenasa I junto con mutaciones en la timidina quinasa confieren resistencia cruzada o tolerancia a múltiples clases de antibióticos. Tanto la timidina quinasa como la aspartato quinasa bifuncional/homoserina deshidrogenasa I están involucradas en última instancia en el metabolismo de los nucleótidos69 y específicamente en la pirimidina timidina. Recientemente se ha propuesto la homoserina deshidrogenasa como diana en la infección fúngica sistémica70. Dado que la zidovudina es un análogo de la timidina, es posible plantear la hipótesis de que un objetivo de la zidovudina pueden ser las vías implicadas en el metabolismo de la timidina, que también pueden influir en la resistencia de E. coli a un espectro de antibióticos. La trimetoprima y el sulfametoxazol, específicamente, se dirigen al metabolismo del tetrahidrofolato, lo que también implica a la timidina y la timidina quinasa71. En otros contextos, se ha demostrado que la zidovudina previene la transferencia de genes de resistencia a los antibióticos mediante transferencia genética horizontal72. Nuestros estudios proporcionan evidencia de que las mutaciones cromosómicas que confieren resistencia cruzada al antiviral zidovudina y una resistencia cruzada ingenua a los antibióticos pueden desarrollarse de novo debido a la presencia del fármaco de exposición. La capacidad de las bacterias para adaptarse a factores estresantes ambientales, incluidos los fármacos, puede provocar muchas alteraciones y adaptaciones diferentes para la supervivencia73,74. Las alteraciones en la función genética pueden ser mecanismos para sobrevivir a un desafío ambiental y provocar o estar asociadas con resistencia a los antimicrobianos66,75,76. Los medicamentos antivirales pueden tener efectos similares a los factores estresantes que conducen a fenotipos de resistencia, aunque se necesitan más estudios para establecer las vías y mecanismos por los cuales los medicamentos antivirales afectan a las bacterias.

Más allá de la exposición a la terapia antiviral oral y el consiguiente riesgo de desarrollar resistencia a los antimicrobianos en el cuerpo humano, la presencia de antivirales y bacterias resistentes a los antivirales procedentes de desechos humanos en el medio acuático plantea un riesgo para el desarrollo y la propagación de resistencia a los antimicrobianos en el medio acuático. Se pueden establecer implicaciones ambientales paralelas entre los antibióticos y los antivirales para subrayar los riesgos de los medicamentos antivirales presentes en el medio ambiente. Los antibióticos como amoxicilina, eritromicina, trimetoprima y sulfametoxazol se detectan comúnmente en aguas superficiales y se han asociado con la presencia de genes de resistencia77,78,79,80,81. También se han detectado antivirales con propiedades antibacterianas en el medio acuático (desde aguas residuales hasta aguas superficiales y agua potable82), pero se desconoce su contribución al desarrollo y propagación de genes de resistencia. Los procesos actuales de tratamiento de aguas residuales a menudo no eliminan suficientemente muchos antivirales de las aguas residuales. Muchos antivirales persisten a través del tratamiento de aguas residuales83,84,85,86 y se liberan al medio ambiente, en concentraciones detectables que varían de ng/L a μg/L. Se han detectado antivirales con propiedades antibacterianas conocidas (es decir, zidovudina y efavirenz) en suelos, aguas superficiales y agua potable, además de aguas residuales50,82,85,87,88. La presencia documentada, la persistencia y las bajas concentraciones crónicas de antivirales en el medio ambiente es un escenario similar a la presencia de antibióticos en el medio acuático. Al igual que los antibióticos, la presencia de antivirales antibacterianos en el medio ambiente podría exacerbar la crisis de resistencia a los antimicrobianos a medida que se desarrollan y propagan genes de resistencia cruzada a los antivirales. La evidencia de antivirales en el medio ambiente resalta el riesgo de exposición bacteriana y humana a los antivirales más allá del contexto del consumo medicinal.

Al desarrollar y aislar nuevas cepas mutantes de E. coli y B. cereus resistentes a los antivirales, demostramos cómo los fármacos no antibióticos, como los antivirales, podrían contribuir a la resistencia a los antimicrobianos. Las bacterias expuestas a medicamentos antivirales individuales desarrollaron mutaciones estables que les confirieron resistencia cruzada a otros antivirales y antibióticos antibacterianos. En el futuro, aislar y desafiar una gran cantidad (>5) de aislados resistentes a los antivirales de cada exposición a los antivirales ayudará a responder si las mutaciones de resistencia a los antivirales son consistentes o estocásticas. Dada la diversidad de bacterias grampositivas y gramnegativas, el uso de cepas adicionales de E. coli y la ampliación de este trabajo más allá de E. coli y B. cereus ayudarán a dilucidar las implicaciones más amplias de los efectos de los antivirales antibacterianos en comunidades bacterianas como las Se encuentra en aguas ambientales, plantas de tratamiento de aguas residuales y en el intestino humano. Es probable que los mecanismos de resistencia a los medicamentos antivirales varíen entre especies e incluso entre cepas de bacterias y, por lo tanto, los patrones de resistencia cruzada que surgen también pueden ser heterogéneos. Los efectos de las mezclas de fármacos (similares a los relevantes en el cuerpo humano o en el contexto altamente heterogéneo de las aguas residuales) sobre las bacterias también merecen una mayor investigación. A medida que el uso y la fabricación de antivirales continúen expandiéndose en todo el mundo, será esencial aprovechar todo el potencial de los antivirales a la resistencia a los antimicrobianos tanto en el cuerpo humano como en el medio ambiente. El riesgo de desarrollar resistencia a los antimicrobianos debido a la presencia de antivirales también puede ser mayor donde la carga de enfermedad viral (y el uso concomitante de medicamentos antivirales) también es mayor. Es probable que la falta de infraestructura de aguas residuales agrave el riesgo, ya que las aguas residuales no tratadas se vierten al medio ambiente y, con ellas, altas concentraciones de medicamentos antivirales y bacterias.

Todos los compuestos antivirales se adquirieron de Toronto Research Chemicals y se certificó que tenían una pureza >98 %. Según la solubilidad, se prepararon soluciones madre de 1, 2 o 10 mg/ml en agua MilliQ o DMSO y se almacenaron en viales de color ámbar en 4 °CE coli (cepa B, número de producto 12-4300) que se adquirió de Carolina. B. cereus se compró en Ward's Science (WARD470176-602). Se adquirió E. coli resistente a múltiples fármacos (número de producto BAA-2471) de ATCC.

Las bacterias se cultivaron inicialmente a partir de agar inclinado en medios esterilizados en autoclave: medios LB, Lennox (Fisher, BP1427-500, lote 188454) para E. coli B o medios de caldo de soja tríptico (TSB) (Teknova, TO420, lote T042010A2001) para B. cereus . Los medios se prepararon según las instrucciones del fabricante. Después de hacer crecer las bacterias hasta la fase estacionaria en matraces T25 con ventilación estéril, las bacterias se sembraron en placas de agar y se seleccionaron colonias individuales para preparar reservas de glicerol (50 % de glicerol, 50 % de bacterias en medio de cultivo) para uso futuro en los experimentos. Para desarrollar cepas resistentes, las bacterias cultivadas en matraces se incubaron con 10 a 100 μg/ml de antiviral durante la noche a 37 °C. Las bacterias se recogieron mediante centrifugación en tubos de microcentrífuga estériles durante 1 min a 4000 RPM. Las bacterias se lavaron con medio LB o TSB, se centrifugaron una segunda vez, luego se resuspendieron en medio y se agregaron a un matraz nuevo con un total de 5 ml de medio nuevo y la misma concentración de antiviral previamente. Las bacterias se volvieron a cultivar durante la noche a 37 °C, luego se sembraron en una microplaca con una densidad óptica inicial de 0,1 y se trataron con antivirales de 0,1 a 100 μg/ml (Datos complementarios 5) para garantizar la resistencia, observada mediante el crecimiento desinhibido de las bacterias en antivirales. -Pozos tratados.

E. coli resistente a múltiples fármacos utilizada para experimentos de control positivo (ATCC BAA-2471) se cultivó en Difco Nutrient Broth (número de catálogo BD 234000) con la adición de 25 μg/ml de imipenem (número de catálogo MedChemExpress HY-B1369/CS-W019618). según las recomendaciones del fabricante para evitar la pérdida del plásmido metalo-beta-lactamasa (NDM) de Nueva Delhi.

Se monitorizó el crecimiento bacteriano, medido como densidad óptica (DO), en diferentes puntos temporales de las curvas de crecimiento de E. coli y B. cereus para comprender mejor la influencia de los medicamentos antivirales a través de las fases de crecimiento bacteriano. La DO es un enfoque común para monitorear el crecimiento bacteriano en cultivo89. Evaluamos la correlación entre la DO y las unidades formadoras de colonias (UFC) en bacterias no tratadas, así como en condiciones que desafían a las bacterias tanto con medicamentos antivirales con propiedades antibacterianas como con medicamentos antivirales sin propiedades antibacterianas putativas, y encontramos que la DO se correlacionaba significativamente con las UFC (Datos complementarios). 2). Dado que el uso de OD permitió realizar mediciones de manera de alto rendimiento, utilizamos OD (absorbancia 600 nm) como indicador del crecimiento bacteriano para monitorear el impacto de los medicamentos antivirales en las bacterias en cultivo.

Se utilizó la densidad óptica (DO) medida a 600 nm para medir el crecimiento bacteriano de E. coli, B. cereus y BAA-2471. Para medir el crecimiento después del cultivo en matraces T25, se midió la DO utilizando un espectrofotómetro UV/Vis Ultrospec 3100 pro de Amersham Biosciences configurado para leer la absorbancia a 600 nm. La DO de las bacterias tratadas con antivirales o antibióticos se midió durante 24 h a una temperatura fijada en 25 °C utilizando un lector de microplacas multimodo Biotek Synergy H1 equipado con el software Gen5 versión 3.09.

Se utilizaron ensayos basados ​​en microplacas para investigar los efectos de los antivirales y los antibióticos en las bacterias. Para todos los experimentos, se inocularon 5 ml de caldo nutritivo LB, TSB o Difco en un matraz T25 con ventilación con un asa de bacterias extraídas de reservas de glicerol congeladas de aislados de colonias individuales. Los cultivos se cultivaron durante 4 a 5 h en una incubadora a 37 °C. Después de la incubación inicial, se midió la DO de los cultivos y las bacterias se diluyeron hasta una DO de 0,1. Utilizando pipetas multicanal, se agregaron 180 μL de bacterias diluidas a una DO de 0,1 a cada pocillo de microplacas estériles de 96 pocillos (BD Falcon 353072). Para cada pocillo, se agregaron 20 µL de antiviral o antibiótico y agua MilliQ (control del vehículo) para alcanzar un volumen de 200 µL en cada pocillo. Utilizando el lector de microplacas Biotek Synergy H1, se desarrolló y aplicó un protocolo establecido para leer microplacas para cada experimento. Las placas se leyeron directamente después de agregar todos los reactivos (bacterias, antivirales o antibióticos) para medir el punto de tiempo cero (T0), agitando primero la placa en el lector de microplacas durante 1 min a 567 cpm. Luego se configuró el lector de placas para que funcionara automáticamente durante un máximo de 18 h, leyendo la DO (600 nm) de cada pocillo cada hora y agitando la placa constantemente con una agitación lineal de 567 cpm. Antes de comenzar el experimento, el lector de placas se ajustó a 25 °C y se mantuvo a 25 °C durante la duración del experimento. Dado que 25 °C es una temperatura relevante para sistemas acuáticos como plantas de tratamiento de aguas residuales y aguas superficiales90,91, se eligió esta temperatura para las condiciones experimentales. Después de hacer funcionar el lector de placas constantemente durante al menos 16 h para capturar mediciones de DO para la fase logarítmica completa del crecimiento bacteriano, se retiró la microplaca y se transfirió a una incubadora de mesa (New Brunswick Scientific Incubator Shaker I2400) ajustada a 25 °C y agitada a 100 RPM hasta 24 h, momento en el que se tomó otra lectura de OD en el lector de microplacas. Directamente antes de leer la placa a las 24 h, la microplaca se colocó primero en el lector de microplacas para agitación lineal durante 1 min a 567 cpm. Las concentraciones de antibióticos para los ensayos de resistencia cruzada a los antibióticos se eligieron en función de los valores de concentración inhibidora mínima (CMI) publicados y de la evaluación experimental del rango de respuesta de crecimiento para cada cepa resistente de E. coli y B. cereus en presencia de un rango de concentraciones de antibióticos. .

Los datos sin procesar de los valores de absorbancia del lector de microplacas se exportaron como un documento de Excel y luego se pegaron en Prism (Prism 9 para macOS). Los análisis estadísticos se realizaron en Prism y Excel. Para probar la importancia de los efectos antibacterianos de los antivirales en E. coli y B. cereus, se realizaron pruebas t individuales para cada punto de tiempo y concentración de antiviral en función de los valores de absorbancia sin procesar de pocillos de bacterias tratados o no tratados por triplicado de microplacas de 96 pocillos. Se utilizó Prism para ejecutar pruebas t no pareadas con corrección de Welch, asumiendo una varianza individual para cada grupo (pocillos por triplicado tratados versus no tratados). Las diferencias se determinaron como significativas si el valor de p alcanzaba el umbral (p > 0,005 se considera no significativo, p < 0,005, p < 0,0005 o p < 0,00005).

La resistencia cruzada a los antivirales de E. coli y B. cereus resistentes a los antivirales se determinó comparando el crecimiento de cepas resistentes a los antivirales y de bacterias de tipo salvaje tratadas y no tratadas. Todas las cepas mutantes y de tipo salvaje se expusieron a 50 μg/ml de antiviral durante 24 h, lo que representó el tiempo desde la fase de crecimiento logarítmico hasta la fase estacionaria. Para los cálculos que comparan el crecimiento de cepas resistentes y de tipo salvaje no tratadas y tratadas con fármacos, se utilizaron los valores de absorbancia en el momento de 16 h, que representa el momento de crecimiento máximo o el final de la fase logarítmica. El porcentaje de crecimiento de las bacterias tratadas con antivirales en comparación con las bacterias no tratadas se calculó basándose en el promedio de los valores de absorbancia sin procesar en condiciones por triplicado para todas las cepas y el tipo salvaje probados. Los antivirales en DMSO se compararon con el control de vehículo DMSO en la condición "sin tratar", y los antivirales en agua se compararon con el control de vehículo acuático en la condición "sin tratar". El crecimiento porcentual se calculó utilizando Excel.

De manera similar, la resistencia cruzada a los antibióticos de E. coli y B. cereus resistentes a los antivirales se determinó comparando el crecimiento de cepas resistentes a los antivirales y de bacterias de tipo salvaje tratadas y no tratadas. Las cepas mutantes y las de tipo salvaje se expusieron a antibióticos en concentraciones predeterminadas basadas en la CIM y la variación en la respuesta entre las cepas de tipo salvaje y resistentes. El porcentaje de crecimiento de las bacterias tratadas con antibióticos en comparación con las bacterias no tratadas se calculó basándose en el promedio de los valores de absorbancia sin procesar en el momento de 16 h en condiciones por triplicado para todas las cepas y el tipo salvaje analizados. Los rangos mínimo y máximo para los efectos de los antibióticos se calcularon comparando los valores de absorbancia mínimos y máximos de condiciones por triplicado de pocillos tratados y no tratados con antibióticos. El porcentaje de crecimiento relativo al control no tratado se calculó utilizando Excel (Datos complementarios 10).

El ADN se extrajo de E. coli de tipo salvaje y resistente a los antivirales cultivadas hasta la fase logarítmica a 37 °C en medios LB o TSB. El ADN genómico bacteriano se aisló a partir de sedimentos celulares utilizando el kit PacBio/Circulomics Nanobind CBB (102-301-900) y siguiendo el protocolo del fabricante para bacterias gramnegativas. Las muestras de ADN se cortaron con Covaris g-Tubes (Covaris, Woburn, MA) hasta un tamaño promedio de 10 a 15 kb. Las bibliotecas con códigos de barras se prepararon utilizando el SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0 (Pacific Biosciences, Menlo Park, CA). Después de la ligadura del adaptador, las bibliotecas se agruparon en cantidades equimolares y luego se seleccionaron por tamaño utilizando un instrumento BluePippin (Sage Science, Beverly, MA) con un límite de 10 kb. El conjunto de bibliotecas se unió a la polimerasa con el kit de unión Sequel II 2.2. La secuenciación se realizó con el kit de secuenciación Sequel II 2.0 y una célula SMRT de 8 M en un instrumento Sequel II (Pacific Biosciences, Menlo Park, CA). Los datos resultantes se demultiplexaron utilizando la utilidad Lima (SMRT Link 10.2) y ensamblajes de genoma de novo generados utilizando Canu v2.2 y el proceso de ensamblaje microbiano PacBio (SMRT Link 10.2). Se secuenciaron tanto B. cereus como E. coli; sin embargo, una muestra de B. cereus contaminada impidió que pudiéramos hacer comparaciones genómicas entre cepas de B. cereus y, por lo tanto, quedó fuera del análisis. Las longitudes totales de los pares de bases de contigs ensamblados individualmente se informan en los Datos complementarios 12. La anotación se realizó utilizando el canal de anotación procariótica GALES (disponible gratuitamente: https://github.com/jorvis/GALES). Los genomas se depositaron en GenBank con la identificación de BioProject PRJA907821 e incluyen números de acceso: CP115180 (E. coli B resistente a estavudina), CP115179 (E. coli B resistente a lamivudina), CP11578 (E. coli B de referencia de tipo salvaje), CP117469 (zidovudina E. coli B resistente), CP117043 (E. coli B resistente a raltegravir), CP117044 (E. coli B resistente a dolutegravir), CP115968 (E. coli B resistente a didanosina).

Las estadísticas de ensamblaje confirmaron un único contig para cada genoma secuenciado y la longitud total de cada genoma como se esperaba para E. coli (~4,6 millones de pares de bases) (Datos complementarios 12). El análisis comparativo de los genomas secuenciados reveló inserciones, eliminaciones y sustituciones únicas de pares de bases únicas, así como inserciones y eliminaciones de pares de bases múltiples en relación con las cepas de tipo salvaje (Fig. 6, Fig. 7, Datos complementarios 13). Se descubrió que algunas mutaciones se conservaban en todos los mutantes secuenciados resistentes a los antivirales, lo que concluimos que en conjunto eran un evento de mutación único en el clon de tipo salvaje durante la selección para la secuenciación (Datos complementarios 13). Todas las mutaciones en cada genoma de E. coli resistente a los antivirales se identificaron basándose en un análisis comparativo con el aislado de tipo salvaje de E. coli B secuenciado (número de acceso CP11578) en la misma serie que las cepas resistentes a los antivirales. Se utilizaron secuencias de comandos Perl personalizadas y BLAST (versión 2.13.0+) para ajustar la posición inicial y la orientación de cada genoma resistente a antivirales anotado, ya que las posiciones iniciales y las orientaciones para cada genoma no eran idénticas en los datos sin procesar. Luego, las coordenadas de los genes se numeraron según la posición inicial unificada para todos los genomas. Se usaron números de codones dentro de cada gen (identificados usando SnapGene Viewer) para describir la ubicación de las mutaciones identificadas enumeradas en las Figs. 6,7. Se utilizó Mummer (4.0beta2) y DNASTAR MegAlign Pro (Versión: 17.4.2) para identificar diferencias genéticas entre los genomas de tipo salvaje y los resistentes a los antivirales. El análisis destacó cualquier diferencia de pares de bases entre los genomas resistentes a los antivirales en comparación con el tipo salvaje. Luego se utilizaron DNASTAR MegAlign Pro y SnapGene Viewer (versión 6.1.1) para realizar una verificación cruzada de cada mutación de par de bases identificada, comparando la secuencia de los genomas de tipo salvaje y resistentes a los antivirales. Se observaron traducciones de secuencias de aminoácidos en SnapGene Viewer, y la identidad de la proteína y la secuencia del gen que contiene la mutación se confirmaron nuevamente usando blastx (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) ingresando la secuencia FASTA. y restringir la búsqueda del organismo a E. coli (taxid:562). Se identificaron eventos de truncamiento en genomas resistentes a los antivirales cuando, en comparación con E. coli B de tipo salvaje, así como secuencias de nucleótidos de otras E. coli (taxid:562) depositadas en GenBank y recuperadas usando blastx, el gen resistente a los antivirales se acortó. después de un codón de parada temprano después de una mutación identificada. El porcentaje de proteína truncada debido a una mutación, informado en las Figs. 6,7, se calculó basándose en la comparación con la longitud del gen B de E. coli de tipo salvaje después del codón de parada en el genoma resistente a antivirales. Para todas las mutaciones informadas en las Figs. Se observaron codones de parada 6, 7 después de la mutación debido a un cambio de marco en el gen introducido por la mutación. Los codones de parada se identificaron observando los tres ácidos nucleicos secuenciales TAG, TAA o TGA. Se utilizó el identificador de genes de resistencia en línea (RGI 6.0.1; https://card.mcmaster.ca/analyze/rgi) para identificar genes dentro de la referencia y genomas mutantes que coincidan con la base de datos integral de resistencia a los antibióticos (CARD 3.2.6) que restringen a criterios de coincidencia perfectos y estrictos. Las diferencias en las secuencias genéticas dentro de los genes de resistencia a los antibióticos se identificaron utilizando un script Perl personalizado. También buscamos en la literatura evidencia de un papel en la resistencia a los antibióticos para los genes que contenían los cambios más significativos en los genes que codifican proteínas. Todos los scripts utilizados para comparar los genomas de las cepas de E. coli B de tipo salvaje y resistentes a los antivirales están disponibles gratuitamente (https://github.com/spacocha/mutant_strain_comparative_genomics).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de origen de las Figs. 3, 4 y 5 se pueden encontrar en Datos complementarios. Todos los genomas incluidos en el estudio se depositaron en GenBank con la identificación de BioProject PRJA907821 e incluyen los siguientes números de acceso: CP115180 (E. coli B resistente a estavudina), CP115179 (E. coli B resistente a lamivudina), CP11578 (E. coli B resistente a estavudina), CP115179 (E. coli B resistente a lamivudina), CP11578 (E. coli B resistente a estavudina). coli B), CP117469 (E. coli B resistente a zidovudina), CP117043 (E. coli B resistente a raltegravir), CP117044 (E. coli B resistente a dolutegravir), CP115968 (E. coli B resistente a didanosina).

Todos los scripts utilizados para comparar los genomas de las cepas de E. coli B de tipo salvaje y resistentes a los antivirales están disponibles públicamente en el siguiente sitio: https://github.com/spacocha/mutant_strain_comparative_genomics.

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Maryland Genomics en el Instituto de Ciencias del Genoma de la Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland completó la secuenciación y anotación del genoma completo, y agradecemos especialmente a Luke Tallon y Lisa Sadzewicz por su asesoramiento sobre el uso de la plataforma PacBio Sequel II. Reconocemos la financiación del Programa de Descubrimiento del Centro Fisher de la Universidad Johns Hopkins. Agradecemos a Marsha Wills-Karp y Anthony So por sus comentarios sobre el manuscrito original.

Departamento de Ingeniería y Salud Ambiental, Universidad Johns Hopkins, Baltimore, MD, EE. UU.

Verónica J. Wallace, Eric G. Sakowski, Sarah P. Preheim y Carsten Prasse

Departamento de Ciencias, Universidad Mount St. Mary, Emmitsburg, MD, EE. UU.

Eric G. Sakowski

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CP y EGS concibieron el estudio inicial y contribuyeron al diseño del estudio, la interpretación y el análisis de los datos. VJW contribuyó a la concepción y el diseño del estudio, realizó todos los experimentos y la recopilación de datos, realizó el análisis de datos y redactó el manuscrito. EGS y SPP contribuyeron a la redacción del manuscrito. SPP contribuyó a la interpretación de datos y al diseño del estudio, escribió guiones personalizados, completó la alineación del genoma completo y la identificación de mutaciones de pares de bases y realizó búsquedas y análisis de CARD. CP proporcionó financiación. Todos los autores participaron en la revisión del manuscrito.

Correspondencia a Carsten Prasse.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Vikas Sharma y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal: Gene Chong. Un archivo de revisión por pares está disponible.

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Wallace, VJ, Sakowski, EG, Preheim, SP et al. Las bacterias expuestas a medicamentos antivirales desarrollan resistencia cruzada a los antibióticos y perfiles de resistencia únicos. Común Biol 6, 837 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05177-3

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Recibido: 05 de noviembre de 2021

Aceptado: 25 de julio de 2023

Publicado: 12 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05177-3

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